PNAS/ 水稻根相关菌群的结构、变异和组装
题目：Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice
水稻根相关菌群的结构、变异和组装
期刊：PNAS（2015）
影响因子：9.6
作者：Joseph Edwards
摘要
通过深度测序，使用在受控条件下生长的植物，以及在多个地点的田间栽培，对水稻作物的根相关微生物群落进行了详细的描述。该研究的空间分辨率区分了三个与根相关的区域，即根内、根面和根际，每个区域都有一个独特的微生物群落。在控制温室条件下，微生物组组成随土壤来源和基因型而变化。在田间条件下，地理位置和栽培方法，即有机与常规种植，是造成微生物组变异的因素（图1）。水稻栽培是全球甲烷排放的主要来源，并且在田间种植水稻的所有空间分区都能检测到产甲烷古菌。这项研究的深度和规模被用来建立共丰度网络，揭示了潜在的微生物群落（ microbial consortia），其中一些参与了甲烷循环。在获取微生物组的过程中观察到的动态变化，以及各个空间分区的稳态组成，支持了从土壤中组装根微生物组的多步骤模型，其中根际起着选择性的门控作用。水稻和其他植物根系微生物群落中门的分布具有相似性，这表明本研究的结论可能普遍适用于陆地植物。
背景：
植物中微生物的获取和组装机制仍不明晰。与动物不同的是，肠道微生物群在体内组装，并通过出生传播，而根微生物群主要是由土壤中的外部微生物组装而成。根据内生和根际微生物组的组成，有人提出植物可以分两步组装它们的微生物组，第一步涉及到根附近的一般招募，第二步涉及到涉及物种特定遗传因素的根内进入。虽然这是一个似是而非的假设，但尚未通过详细的动态研究为这一模型提供直接支持。此外，根表面或根面（构成植物和土壤之间的关键界面）的作用还不清楚，根面的微生物组成与根际和内生圈的微生物组成也不清楚。
意义：
陆生植物通过根不断地接触土壤中有益的、共生的和致病的微生物。对于根相关微生物（即微生物组）的整体性是如何由各种因素或其在根中的获取模式所形成的，人们的知识是有限的。以水稻为模型，我们发现存在着三个不同的根系生态位，分别存在着真细菌和产甲烷古菌的不同微生物群落。这些微生物群落受地理位置、土壤来源、宿主基因型和栽培实践的影响。根相关微生物在三个根生态位中的定殖动态为从土壤中快速获取根相关微生物提供了证据，并支持一个多步骤模型，其中每个根生态位在微生物群落组装中都起到选择性作用。
实验设计：
3个地点采集土壤分别混匀（测土壤理化）→温室土壤（前面所采）种植6个品种水稻→采样→大田实验（差异于管理方式：生态管理/有机管理）
主要结果与讨论
1. 根内、根表面及根际表现出可区分、重叠的微生物群落
图1所示，根相关的微生物群落可以根据根室和土壤类型来区分。(A)描绘取样的微生物群落位置的水稻根截面图。(B)α-多样性测量各土壤类型下，从根际到根内微生物多样性的下降梯度。物种丰富度估计数以eShannon_entropy计算。框内的横杠表示中位数。盒子的顶部和底部分别代表75分位和25分位。上下晶须分别从盒的上边缘和下边缘延伸1.5个四分位范围。所有的离群点都被画成单独的点。(C)利用WUF度量的PCoA表明，微生物群落之间最大的分离是在近根空间(PCo1)，第二大变异来源是土壤类型(PCo2)。(D)每个室和土壤中丰度的柱状图。B,空白土壤;E, 根内;P, 根面; S, 根际 Sac, Sacramento。
图1B显示α-多样性梯度从根际到根内呈下降趋势。图1C表明与根相关的微生物群落中最大的变异来源是根隔间的空间位置(图1C、WUF)。在每个被测土壤中，在隔室中不同门的比例有显著的差异(图1D)。与根际或空白土壤相比，根内的Proteobacteria （变形菌门）和 Spirochaetes（螺旋体门）的比例要大得多，而Acidobacteria（酸杆菌门）, Planctomycete（浮霉菌门）,及 Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）在内层的比例要比块状土壤或根际的比例少的多。
2.显著富集的OTUs与不同根室的关联
图2所示(A)差异丰度分析确定与空白土壤对照相比，温室试验中每个隔室otu的富集和损耗，每个点代表一个单独的OTU，沿y轴的位置代表相对于空白土的丰度变化。(B)与土壤相比每个隔室之间的差异富集otu数量。(C)与土壤相比每个隔室之间的差异损耗otu数量。
图2A可看出根际与块状土壤最相似，且对微生物的排除作用很小，只有17个otu明显减少;根表面上调了许多otu，但同时有更大比例的otu减少：根内是最独特的区域，394个otu被富集，1961个otu被消耗 。图2 B所示，在不同的otu中明显的重叠。在根际富集的OTUs在其它两个区域的定植也比较成功。根平面和内层是最相似的根室，同时有271个 OTUs上调。大多数富集于根平面和内层隔间之间的OTUs，属于一类通过光合作用产生能量的细菌门。图2C，几乎所有从根际被阻隔的OTUs在根平面和内层群落中也被阻隔。根平面下调的1961个otu中的有713个与内层下调的otu共享。这些结果表明，植物控制的根际土壤的变化是微生物对根定殖的第一级排斥，根平面的选择性可能是控制微生物进入根内圈的有效途径。
3.微生物群落在根室中的分布因土壤类型而异。
图1C 显示，生长在不同土壤中的植物根际样品沿第二轴分离，分离模式在每个隔间中都有体现。Arbuckle和Davis虽然在地理上最分散，但它们之间的相似性最大。使用WUF距离的PERMANOVA支持PCoA的结果，即土壤效应描述了实验中被测因素的第二大变异来源(20.2%, P = 0.005)。使用UUF距离测量的PERMANOVA表明，土壤效应是被测因素中变化最大的来源(20.90%，P < 0.001)。
CAP分析结果与PERMANOVA一致。并且每个根际隔室的富集/损耗比例因土壤而异。综上所述，这些结果表明每个土壤包含不同的微生物库，并且该植物并不局限于特定的otu，而是从库中可用的otu中提取来组织其微生物群落。然而，三种土壤类型的门在不同隔间的分布是相似的(图1D)，这表明OTUs的整体补充是由一系列因素控制的，这些因素导致了门的一致表达，而与土壤类型无关。
4.根室微生物群落受水稻基因型的影响。
图3 寄主植物基因型对根际区微生物群落有显著影响。(A)利用约束水稻基因型的WUF度量对CAP分析进行排序。(B)对每一土壤中生长的每个品种的根际样品的样品内多样性进行测量。
图3A显示水稻基因型差异对根相关微生物群落有显著影响，品种的聚类模式只与遗传谱系部分一致。 2个粳稻品种聚在一起，2个非洲栽培稻品种聚在一起;而籼稻品种被分离，其中93-11与非洲栽培稻品种聚类，IR50与粳稻品种聚类。利用CAP分析基因型效应在单个根室中的表现，根际微生物组受基因型影响最大。图3B表示不同品种根际中微生物多样性表现出显著的差异，两个粳稻品种与籼稻品种IR50的相似性更大，而两个非洲栽培稻品种与籼稻品种93-11的相似性更大。
5.地理环境对田间种植植物微生物群落的影响
图4田间种植的植物根相关微生物群落可根据栽培地点、根际间隔和栽培实践加以区分。(A)描绘横跨加州中央山谷的实地试验收集地点的地图。圆圈代表有机栽培的地点，而三角形代表生态农场栽培的地点。(比例尺，10英里)(B) PCoA使用着色的WUF方法描绘不同的采样点。(C) B中PCoA将根际间隔着色。(D) B和C中相同的PCoA描绘第二和第三轴，将栽培方式着色
使用WUF和UUF指标的Unconstrained PCoA表明，微生物群落被田间站点沿第一轴分隔(图B）。PERMANOVA结果也与该田间站点的无约束PCoA吻合，田间站点位置解释了田间植物微生物群落间最大比例的差异(30.4%的方差，P < 0.001和26.6%的方差，P < 0.001P)。受场地限制，受根室、栽培实践和技术因素控制的CAP结果与PERMANOVA 一致，表明地理因素可能影响根相关微生物群落。使用WUF和UUF距离度量的田间植物微生物群落的PCoA显示，在田间植物中，根隔间的空间划分仍然存在(图C)。栽培方式使微生物群落有了明显的差异。在无约束PCoA下，WUF度量的主坐标2和3上的不同栽培方式是可分离的(图D)。微生物群落的PERMANOVA与PCoAs一致，栽培实践对田间水稻植株根际微生物群落有显著影响(8.47%，P < 0.001, WUF 和6.52%，P < 0.001, UUF )。
6.参与甲烷排放的微生物OTUs协丰度网络的识别
OTU丰度网络揭示了与甲烷循环相关的OTU模块。(A)整个网络对应11个具有甲烷循环潜力的模块的子集。每个节点表示一个OTU，如果OTU之间的Pearson相关性大于或等于0.6，则在OTU之间绘制一条边。(B)模块119的描述，显示产甲烷菌、共生生物、产甲烷生物和其他甲烷循环分类的关系。每个节点代表一个OTU，并根据该OTU分类在甲烷循环中的假定作用进行标记。如果两个otu的Pearson相关系数大于或等于0.6，则在它们之间画一条边。(C)模块119中田间 OTUs的平均丰度剖面。沿x轴的位置对应于不同的场地。误差条代表SE。x轴和y轴没有特定的比例。采用了类似于基因共表达网络构建的方法来生成OTU共丰度模块。鉴定了15个含有产甲烷OTUs的模块，与同一模块内的其他otu的相关系数为0.6或更大(11个如图5A所示。含产甲烷类群的模块被丰富，OTUs具有产甲烷、共养和CH4循环电位(图5B)。
7.从根部获取微生物群落
图中根相关微生物群落的时间序列分析揭示了独特的微生物群落定植模式。(A)微生物与器官(质体和线粒体)16S rRNA基因的比值。42 d时间点对应于Davis土壤中M104的早期温室试验数据(图1)。比率的平均百分比用每个柱状图表示。(B)时间序列试验和温室试验的PCoA，属于Davis土壤中生长的植物(C)移植入土壤后收集日的PCoA与B相同D)所选门在获取微生物组过程中的平均相对丰度。(E)92个根内层富集OTUs中的53个otu在根际的平均丰度剖面。误差条代表SE。
使用微生物reads与细胞器(质体和线粒体)reads的比例来分析随时间变化的微生物数量(图A)。以此确定了移植前幼苗根系的无菌性。短暂的土壤接触并不会显著增加微生物reads的比例，因此在24小时内微生物reads的增加表明移植后1天内获得了内生菌。
β-Diversity测量的时间序列数据表明,来自不同间隔的微生物样本可以在时间上区分开(图6 和C)。随着时间的推移，门的分布有轻微的变化;然而，在移植到土壤中24小时后开始的隔间之间就有明显的区别(图D)。平均丰度剖面揭示了核心内层微生物群落的定殖模式：根内相对富集的微生物群落早期(3d)在根际达到峰值，然后在剩余的时间点下降到稳定的低水平。同样,根平面显示的是3 d后增加 8 d达峰值，13 d下降。除了相对丰度在13 d时仍在增长，根内大体遵根平面。这些结果表明,根内核心微生物首先被吸引到根际,然后定位到rhizoplane,附上之前迁移到根内部。综上所述，从土壤中获取微生物组的过程相对较快，24 h内开始，14 d内趋于稳定。积累的动态暗示了一个多步骤的过程，在这个过程中，根际和根平面可能在决定根相关的微生物群落的内部和外部组成方面起关键作用。
讨论
1.影响根相关菌群组成的因素
在受控的温室条件下，根隔室解释了采样的微生物群落中最大的变异来源。根室中某些微生物的富集和消耗表明，微生物对水稻根的定植不是一个被动的过程，植物有能力选择特定的微生物群落，或者某些微生物更善于填补根定植生态位。不同的细菌类群的分布在所有陆生植物的根可能相似。在受控温室条件下，土壤类型是每个样本微生物群落的第二大变异来源。然而，土壤来源并不影响根际间隔的分离模式，这表明根际间隔对独立于微生物群落来源的微生物群落具有补充作用。内部定殖的选择性发生在根平面，而根平面可能在限制微生物渗透到内层起到重要的控制作用。每个隔间中观察到的群落结构可能不仅仅是由植物引起的。微生物群落结构的差异也可以归因于微生物之间的相互作用，包括竞争和合作。在大田植物中，研究发现使微生物组分离的最大来源是栽培地点，而不是其所存在的根空间间隔。这些结果与土壤效应是第二大变异来源的对照温室实验形成对比，表明地理因素可能比土壤结构更重要地决定根微生物群落的组成。田间试验发现，栽培方式解释了大量的微生物群落之间的变化，并且这种影响在每个根际间隔中都表现出来。
2.与稻田甲烷循环有关的微生物群。
研究探索了一种甲烷与水稻根相互作用的方法，即构建OTU丰度网络。假设生产或使用CH4的微生物可能会形成联盟，这将通过分析揭示。对这些集群中的单个OTUs进行检查，发现了已知与CH4循环有关的其他分类，如甲烷菌、同养菌和CH4循环的真细菌。这些簇中还含有未被发现参与CH4循环的OTUs。这种方法可以推广到与培养无关的其他微生物群的鉴定，这些微生物群参与了与植物根相互作用的不同类型的地球化学循环。然而，这种方法可能更适用于那些与某些特性(如CH4循环)紧密相关的微生物谱系，而且当某一特性在与谱系无关的情况下更广泛传播时(如固氮)，这种方法可能不会成功。
3.微生物组获取的多步模型。
在微生物组获取的早期阶段对这些隔室的微生物组成进行时间级分析。结果表明，水稻从土壤中获得微生物群落的速度较快，即水稻植株从无菌培养基移植到土壤后，在一天内就开始形成内层微生物群落，在2周内相对水平趋于稳定。13-d的胚层和根平面的微生物群落与我们认为代表稳定状态的42-d的更成熟的温室实验的微生物群落最为相似，因为后者的微生物群落来自于成熟的植物生长。由于在温室和采集试验之间使用了不同批次的土壤，需要注意的是，由于土壤批次之间的季节性变化，不同试验之间的微生物群落可能无法直接进行比较。在水稻移栽到土壤中24小时内，水稻室间门的相对丰度变化明显。基于对根际和内层稳态微生物群落的研究，有人提出植物可以通过两个步骤来组装它们的微生物群落，第一步涉及招募到附近的根和第二步进入根内涉及种特异的遗传因素。我们研究中微生物组获取的动态为该模型提供了实验支持，我们认为根平面起着关键的控制作用;在被吸引到根际的微生物中，只有一小部分能与根平面结合，其中一小部分被允许进入根际并在根际内增殖。每一个步骤都可能涉及来自植物的分子信号，可能是根分泌物的成分，也可能是细胞壁成分或膜蛋白。这些信号可能包括一般的植物代谢物以及物种和基因型特异性分子。综上所述，每个隔室微生物群落的动态变化表明，在不同的空间位置上，有三个或更多的选择步骤的作用，以及对来自植物的多个信号的响应，协调了根微生物群落的组装。
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